Hoefer IEF100 - Manuel (Page 58)

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Lignes directrices générales
• Procédures de préparation des échantillons sont en cours de
perfectionnement et standardisée. Il est préférable de consulter la
littérature pour déterminer si un tampon échantillon particulier la
préparation est recommandé pour le type d’échantillon.
• IEF fonctionne mieux avec des échantillons de protéines pures qui
sont solubilisés et dénaturés, et libre de molécules interférant.
• Retirer le matériau insoluble avec centrifugation.
• Gardez la teneur en sel aussi bas que possible.
• Utilisez fraîchement préparés réactifs de haute qualité, ou des solu-
tions de réactifs qui ont été stockés congelés.
• Ne laissez pas des solutions d’urée à la température ambiante
pendant de longues périodes de temps.
• Ne jamais chauffer les échantillons de protéines dans les solutions
d’urée. Chauffer la carbamylation cause de protéines et de modifier
la charge native des protéines.
• Conserver les échantillons sur la glace pour empêcher la
dégradation.
• Ajouter inhibiteurs de la protéase pour empêcher l’activité de la
protéase. Inhibiteurs de la protéase tels que PMSF ou Pefabloc peut
être ajouté à inhiber l’activité de sérine protéase tandis pepstatine
peut inhiber protéases aspartiques.
• Certains protocoles utilisent des ampholytes porteurs de base ou tris
pour obtenir un pH élevé dans le tampon d’échantillon. Cela permet
de solubiliser certaines protéines et diminue l’activité enzymatique
qui attaquent les protéines.
• ADN et l’ARN peuvent souvent être éliminés par ultracentrifuga-
tion. L’échantillon peut également être traités à la DNase et RNase
solution pour briser les contaminants.
• Gardez à l’esprit que certains inhibiteurs de la protéase, DNase et la
RNase sont des protéines elles-mêmes et peuvent apparaître sur une
carte 2D.
• L’eau utilisée pour la fabrication de réactifs doivent être de la
plus haute qualité disponible. D’eau avec une résistivité de > 5 cm
mégohm-est le meilleur. De l’eau purifiée par osmose inverse ou de
l’eau désionisée est acceptable.
Remarque: Les sels sont peut-être
le contaminant le plus commun qui
entraîne des résultats IEF pauvres.