Hoefer PR625 Immunoblot - Manuel (Page 18)

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Annexe B: Détection utilisant
des systèmes de détection ECL
Western blot
Hoefer vous recommande d’effectuer l’étique-
tage et la détection sur les transferts en suivant
les instructions fournies dans votre étiquetage
Western blot et kit de détection. Ci-dessous est
un protocole général sur la base du GE Health-
care (anciennement Amersham Biosciences) ECL
Kit de détection de l’Ouest blot.
Il existe plusieurs systèmes de détection ECL
Western blot disponibles.
Le protocole général suivant est suggéré:
1
Après l’électrophorèse et le transfert de protéines
séparées de nitrocellulose ou de PVDF (faible Hybond
LFP fluorescent pour la plus haute sensibilité)
membrane, de bloquer les sites non spécifiques avec
une solution appropriée de blocage.
2
Le blocage est suivi par deux lavages rapides dans
Tween PBS/0.1% (PBS-T).
3
Immerger et incuber la membrane avec un anticorps
spécifique d’un antigène principal de la concentration
optimisée.
4
Enlever la membrane avec deux lavages rapides de
PBS-T suivie de 2 lavages plus longue (2 × 5 min
avec bascule).
5
Incuber la membrane avec une concentration optimi-
sée de l’anticorps secondaire conjugué.